단백질의 3차원 구조를 컴퓨터로 역설계하는 데 노보(De novo) 디자인 분야는 최근 인공지능 기법의 도입으로 큰 전환점을 맞이했습니다. 과거 물리 기반 에너지 함수(Rosetta 등)를 이용한 방식은 방대하고 복잡한 구조 탐색 공간의 한계로 인해 표적 결합 단백질(Binder)이나 대칭 올리고머 설계 시 수만 개의 후보군을 스크리닝해야 하는 비효율이 존재했습니다.
본 글에서는 미국 워싱턴 대학교 데이비드 베이커(David Baker) 교수 연구팀이 국제 학술지 Nature (2023년 8월)에 발표한 원저 논문 “De novo design of protein structure and function with RFdiffusion” (Watson et al., 2023)의 핵심 기술 아키텍처와 실험적 검증 데이터를 사실 위주로 정리합니다.
1. RFdiffusion 아키텍처: 단백질 구조 노이즈 제거와 자체 조건화(Self-Conditioning)
RFdiffusion은 이미지 생성에 널리 쓰이는 노이즈 제거 확산 확률 모델(DDPM)의 원리를 단백질 백본 생성에 이식한 프레임워크입니다.
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기본 구조 표현: 단백질 구조를 각 잔기별 Cα 좌표와 N-Cα-C 강체 방향(Rigid orientation) 프레임으로 표현합니다. 순방향(Noising) 과정에서는 Cα 좌표에 3차원 가우시안 노이즈를 더하고, 회전 행렬 다양체(SO(3)) 상에서 브라운 운동을 통해 회전 노이즈를 최대 200단계까지 주입합니다.
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역방향(Denoising) 학습 및 손실 함수: 기존 RoseTTAFold의 가중치를 미세조정(Fine-tuning)하여 잡음이 낀 좌표로부터 원래 단백질 좌표를 복원하도록 훈련되었습니다. 학습 시 구조 정렬을 수행하지 않고 프레임 예측과 실제 구조 사이의 평균 제곱 오차(MSE Loss)를 최소화하도록 설계하여, 시간 단계(Timestep) 간 글로벌 좌표계의 연속성을 유지하도록 했습니다.
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자체 조건화(Self-Conditioning) 도입: AlphaFold2의 ‘리사이클링(Recycling)’ 원리와 유사하게, 각 역확산 단계 t에서 이전 단계(t+1)가 예측했던 초기 구조(X̂₀)를 템플릿 입력으로 다시 전달받아 좌표 예측의 일관성(Coherence)과 성공률을 향상시켰습니다.
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서열 설계 연계: 생성된 백본 골격 좌표는 ProteinMPNN으로 넘겨져 아미노산 서열이 할당됩니다.
2. 단백질 바인더 설계(Binder Design) 성능 및 실험적 검증
논문에서 가장 주목받은 성과는 기존 결합 파트너 정보가 없거나 특정 부위만을 공략해야 하는 단백질 타깃에 대해 고친화도 결합체를 직접 설계한 결과입니다.
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핫스팟 잔기(Interface Hotspots) 조건화: 표적 단백질 사슬에서 결합시키고자 하는 특정 아미노산 잔기 목록을 입력 피처로 부여하여, 확산 중인 사슬이 해당 에피토프를 정밀하게 둘러싸도록 유도했습니다.
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5종 표적 단백질 대상 실험 결과:
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인플루엔자 A H1 헤마글루티닌 (HA)
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인터루킨-7 수용체 알파 (IL-7Rα)
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인슐린 수용체 (InsR)
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면역관문 단백질 PD-L1
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트로포미오신 수용체 키나아제 A (TrkA)
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실험 성공률: 5개 타깃에 대해 타깃당 100개 미만의 후보군을 대장균에서 발현·정제하여 바이오레이어 간섭계(BLI, 10 μM 농도)로 결합을 측정한 결과, 양성 대조군 대비 50% 이상의 신호를 보인 바인더의 평균 실험 성공률은 19%에 달했습니다. 이는 기존 물리 기반 Rosetta 파이프라인 대비 약 2개 차수(Orders of magnitude) 높은 효율입니다.
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결합 친화도 및 특이성: 추가적인 실험실 진화(Directed evolution) 없이 설계 직후 나노몰(nM) 수준의 해리 상수(KD)를 보였습니다. HA 바인더(HA_20)는 KD ≈ 28 nM, IL-7Rα 바인더는 KD ≈ 30 nM의 친화도를 기록했습니다.
3. 초저온 전자현미경(Cryo-EM) 구조 검증 (HA_20 복합체)
RFdiffusion이 설계한 결합 모드의 원자 단위 정확성을 입증하기 위해 인플루엔자 헤마글루티닌(Iowa43 H1)과 설계 바인더(HA_20) 복합체의 3차원 Cryo-EM 구조를 규명하였습니다.
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구조적 규명 지표: 2.93 Å 해상도의 Cryo-EM 맵을 얻었으며, 3량체 HA 줄기(Stem) 영역의 3개 에피토프에 HA_20 분자가 완벽히 결합한 구조가 확인되었습니다.
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설계 모델과의 정합성:
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실험으로 결정된 전체 복합체 구조와 계산 설계 모델 간 백본 RMSD는 0.63 Å에 불과했습니다.
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결합체 단독 구조(Monomer) 기준 백본 RMSD는 $0.60 Å였습니다.
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PDB 검증 통계에서 MolProbity 점수 0.92, Clashscore 1.67, 라마찬드란 허용 범위 98.72%(0.00% 이상치)를 기록하여 물리적·화학적 타당성을 입증했습니다.
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4. 고차 대칭 올리고머 및 기능성 모티프 스캐폴딩
바인더 설계 외에도 RFdiffusion은 다양한 구조적 제약 조건 하에서 단백질 백본을 생성할 수 있음을 증명했습니다.
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고차 점군 대칭체(Symmetric Oligomers): 순수 노이즈에 대칭 변환 행렬을 적용하여 환형(Cyclic; C3, C6, C8, C10), 양면(Dihedral; D3, D4), 4면체(Tetrahedral), 20면체(Icosahedral) 구조를 설계했습니다. 음염색 전자현미경(nsEM)을 통해 C8 확장형 TIM 배럴 구조와 15 nm 직경의 20면체 거대 케이지(HE0902) 등이 계산 설계 모델과 일치함을 확인했습니다.
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기능성 모티프 스캐폴딩: p53-MDM2 결합 헬릭스를 고정하고 외곽 접촉 면적을 확장하는 설계를 통해 천연 펩타이드(600 nM) 대비 1,000배가량 향상된 0.5 nM 친화도의 저해제를 확보했습니다. 또한, C4 대칭 구조 내에 히스티딘 잔기를 평면 사각(Square-planar)으로 배치하여 Ni2+ 금속 이온을 나노몰 수준에서 배위하는 신규 금속 결합 단백질을 성공적으로 합성했습니다.
참고 문헌 (References)
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Watson, J. L., Juergens, D., Bennett, N. R., Trippe, B. L., Yim, J., Eisenach, H. E., Ahern, W., Borst, A. J., Ragotte, R. J., Milles, L. F., Wicky, B. I. M., Hanikel, N., Pellock, S. J., Courbet, A., Sheffler, W., Wang, J., Venkatesh, P., Sappington, I., Torres, S. V., Lauko, A., De Bortoli, V., Mathieu, E., Ovchinnikov, S., Barzilay, R., Jaakkola, T. S., DiMaio, F., Baek, M., & Baker, D. (2023). De novo design of protein structure and function with RFdiffusion. Nature, 620(7976), 1089–1100. https://doi.org/10.1038/s41586-023-06415-8
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Dauparas, J., et al. (2022). Robust deep learning-based protein sequence design using ProteinMPNN. Science, 378(6615), 49–56. https://doi.org/10.1126/science.add2187
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Cao, L., et al. (2022). Design of protein-binding proteins from the target structure alone. Nature, 605, 551–560. https://doi.org/10.1038/s41586-022-04654-9